Das Forschungsteam um Chase Beisel vom Würzburger Helmholtz-Instituts für RNA-basierte Infektionsforschung (HIRI) hat den CRISPR-Werkzeugkasten um den Neuzugang der Technologie PUMA zur präzisen Detektion von RNA mit DNA-schneidenden Cas12-Nukleasen ergänzt. Dies ist für molekulare Biomarker von Bedeutung, die nur auf RNA-Ebene gefunden werden können: unter anderem die von krankheitserregenden RNA-Viren.
Die bakteriellen CRISPR-Cas-Abwehrsysteme haben sich zu einer bedeutenden Ressource für molekulare Diagnoseverfahren entwickelt. Forschende des Würzburger Helmholtz-Instituts für RNA-basierte Infektionsforschung (HIRI) haben diesen umfangreichen Werkzeugkasten nun erweitert: Ihre neuartige Technologie, PUMA genannt, ermöglicht den Nachweis von RNA mit Cas12-Nukleasen, die herkömmlicherweise DNA schneiden. Die Methode verspricht dabei vielseitige Anwendungsmöglichkeiten und hohe Genauigkeit.
Bei diesen sogenannten CRISPR-Cas-Systemen, die auf einem speziellen Abwehrmechanismus von Bakterien gegen Viren beruhen, erkennt eine CRISPR-Ribonukleinsäure (crRNA), die als „Leit-RNA“ dient, Regionen fremden Erbguts, zum Beispiel DNA eines Virus. Die von der crRNA geleitete Nuklease (Cas) macht diese DNA dann unschädlich, indem sie sie wie eine Schere zerschneidet.
Das Forschungsteam um Chase Beisel hat nun die einzigartigen Funktionen der Genschere auf Cas12 ausgeweitet. Die daraus entstandene Technologie hat das Team PUMA getauft (Programmable tracrRNAs Unlock protospacer-adjacent Motif-independent detection of ribonucleic Acids by Cas12 nucleases).
Auch die Diagnostikplattform LEOPARD – eine Erfindung des Beisel-Labors in Zusammenarbeit mit der Julius-Maximilians-Universität Würzburg (JMU) aus dem Jahr 2021 und inzwischen mit Leopard Biosciences 2023 ausgründet – beruht auf der CRISPR-Technologie und ermöglicht den Nachweis einer Vielzahl von krankheitsbezogenen Biomarkern in nur einem Test. Der Ansatz basiert darauf, RNA-Faktoren, so genannte tracrRNAs, umzuprogrammieren. Diese RNAs sind von Natur aus an der Herstellung von Leit-RNAs beteiligt, die manche Cas-Nukleasen verwenden. LEOPARD konzentrierte sich auf Cas9, PUMA jetzt auf Cas12. Während beide DNA-Zielmoleküle schneiden können, kann Cas12 das ausgehende Signal erhöhen, indem es „kollaterale“ DNA schneidet. Dies macht die Nachweismethoden empfindlicher und damit effizienter.
Zwar sind Cas12-Nukleasen in der molekularen Diagnostik bereits weit verbreitet, doch gab es bisher zwei entscheidende Einschränkungen: Zum einen waren Cas12-basierte Technologien auf DNA beschränkt. Zum anderen musste für den Einsatz der Nuklease eine Erkennungssequenz, genannt PAM (vom engl. protospacer-adjacent motif), vorhanden sein, die das Zielmolekül ausweist.
Wie LEOPARD stützt sich PUMA auch auf tracrRNAs. „Mithilfe von PUMA können wir die tracrRNAs umprogrammieren. So steuern wir, welcher RNA-Biomarker in eine Leit-RNA umgewandelt wird. Diese Leit-RNA wiederum steuert Cas12 zu einem DNA-Molekül, das wir bereitstellen, und aktiviert die Genschere“, erklärt Erstautor Chunlei Jiao, der bereits maßgeblich an der Entwicklung von LEOPARD beteiligt war. Anhand der geschnittenen DNA kann dann festgestellt werden, welcher Biomarker, die für verschiedene Krankheitserreger spezifisch sind, in der Probe vorhanden war.
Die neuartige Technologie ermöglicht folglich die Erkennung von RNA-Biomarkern mithilfe von CRISPR-Nukleasen, die normalerweise nur DNA nachweisen können. Dabei kommt PUMA ganz ohne Erkennungssequenz aus, die stattdessen im mitgelieferten – verkürzten - DNA-Zielmolekül enthalten ist und die Geschwindigkeit der Methode deutlich erhöht. Das Team stellte die Leistungsfähigkeit der Methode unter Beweis, indem es aufzeigte, dass PUMA fünf verschiedene bakterielle Erreger nachweisen kann, die mit akuter Sepsis in Verbindung gebracht werden.
Seine Ergebnisse hat das Team in der Fachzeitschrift Nature Communications veröffentlicht.